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食品级脊蛙坐骨神经的分离与性质检定

成修屹$^1$,黄渤涵$^{1,\dagger}$,李怡洁$^{1,\dagger}$,刘尹卓$^{1,\dagger}$,张笑$^{1,\dagger}$,张雨涵$^{1,\dagger}$,申雪峰$^{1,2,3,}$ $^1\quad UCAS\quad$中国科学院大学 $^2\quad SUAT\quad$中国科学院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所 $^3\quad Lead \ Contact$ $^\dagger \quad These\ authors\ contributed\ equally$ $^ \quad Correspondence:$ xf.shen@siat.ac.cn URL: http://nimbusaina.bio/p/食品级脊蛙坐骨神经的分离与性质检定/ ¹

摘要

屈肌反射作为人们最早发现的经典反射,在脊蛙上具有显著的可测量的实验效果, 基于脊蛙的局部屈肌反射反射弧(坐骨神经与腓肠肌)和刺激-张力感受系统(RM-6240C生理实验系统+张力换能器+肌槽)我们先后进行了刺激强度-张力,刺激频率-张力,不应期测量,传导速率测量等相关实验, 得以对神经反射相关性质和机制有一个更深一步的理解.

引言

在神经生物学的研究中,反射与环路始终是绕不开的话题. 在神经生物学的早期研究中,由于技术的局限性研究者们很难直接在精细的神经纤维上进行神经操作,因此挑选合适的实验动物选择合适的神经纤维和反射对于研究神经环路基本功能特点来说至关重要.

脊蛙, 即脊髓休克的青蛙. 因为已经没有大脑，它所有的反射都是通过脊髓来完成的。

脊蛙作为神经生物学中的经典实验动物曾被用于许多经典实验如: Sherrington反射弧研究,Hodgkin-Huxley模型验证等. 脊蛙模型具有以下优势: 1) 脊蛙的神经系统相对简单但功能齐全，尤其是在反射弧、运动控制和中枢神经功能方面，便于研究基本的神经机制。 2) 脊蛙体型适中，解剖容易，神经结构如脊髓和坐骨神经较为粗大，便于电生理记录和显微操作。 3) 脊蛙的组织（如神经和肌肉）在离体条件下能够长时间存活并保持活性，非常适合在离体准备中研究神经-肌肉接头功能、突触传递和电生理特性。4) 脊蛙对实验环境的适应能力强，不需要复杂的饲养设施，实验室条件下容易维持。6) 脊蛙腿部肌肉发达,刺激坐骨神经产生的张力大,容易检测。5) 脊蛙在实验后洁净的部分可以再利用, 如: 成为盘中餐. 因此,脊蛙是研究坐骨神经功能性质的不二选择.

结果

刺激强度与骨骼肌收缩强度存在显著的正相关关系

将分离制备得到的坐骨神经－腓肠肌标本置于刺激-张力感受系统中对其进行12次等时间间隔的电刺激,使电刺激随时间逐渐增强由$0.25mV-0.36mV$.观察到肌槽中腓肠肌受到电刺激后收缩,且收缩强度逐渐升高. 记录张力数据:

图1 a	图1 b

图1: 图a为信号采集图像,图b为根据数据绘制出的曲线关系.

可以很明显的看出两者成正相关, 进一步验证了骨骼肌收缩张力与动作电位(终板电位)的大小成正比的结论, 但遗憾的是由于对于张力的测量并不精确,该定量关系并不准确未能得到描述其关系的相应曲线.

刺激强度与动作电位之间存在S形曲线关系

虽然张力与刺激强度的关系曲线无法直接得到,但是我们知道肌肉收缩是由骨骼肌动作电位引起的,因此我们可以更直接的测量电刺激在神经纤维上引发的动作电位的大小.

以ch1为信号输出,ch2信号输入(接受), 探测坐骨神经上阈电位与其激发的动作电位.输入的电信号每10ms一次,每次增加0.1V,信号强度由0.2V逐渐增加到3.3V截至. 采集到如下图的数据

图2 a	图2 b

图2 c

图2 a 为采集到的整体信号曲线 图2 b 为动作电位恰好产生时附近的信号放大 图2 c 将从恰好产生动作电位开始的阈强度与动作电位的大小进行绘图拟合得到的S形关系

如上图所示, 刺激强度在1V附近时开始成功激发动作电位, 且动作电位的大小与阈强度程S曲线关系, 对曲线进行Logist回归拟合得到: $$ Y=\frac{4.5}{1+e^{(-3.5\times (X-1.5))}}-0.6 $$ 计算$R^2$值为0.98261, 可见拟合较好. 其中Y即动作电位强度趋于3.8mV. 说明牛蛙坐骨神经的电位信号存在一个极大值.

电刺激频率域与动作电位产生的形式和强度高度相关

对坐骨神经施加不同频率的电刺激会引发不同频率的肌肉收缩,当肌肉还未来得及松弛下一波刺激到达时会引起肌肉的僵直. 记录相关波形数据:

图3 a	图3 b

图3 a 经典条件下刺激频率与张力表现 图3 b 现代条件下刺激频率与张力表现

首先进行的经典实验可以看出在1V的刺激下,随着刺激频率的升高肌肉收缩频率升高,当频率达到20Hz时肌肉已处于僵直状态(强直收缩). 为了进一步探明样品腓肠肌的僵直临界点, 进行如b所示的现代实验——增加了频率梯度. 可以看出在1V的刺激下当频率达到9Hz时肌肉因为疲劳逐渐处于僵直状态(不完全强直收缩),当频率达到11Hz时肌肉完全僵直(完全强直收缩). 且随着频率进一步增高肌肉僵直力度逐渐变大.

坐骨神经不应期的测定

神经在一次兴奋后，其兴奋性发生周期性的变化，而后才恢复正常。一般把 这些变化分为四个时期：绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期。不应期是由离子通道暂时失活引起的, 因此时间尺度极小,需要进一步缩短两次刺激之间的时间间隔才能观察到.

在短时间内对坐骨神经施加两次一定强度持续0.5ms的电刺激,刺激间隔由4.5ms逐渐降低(每次降低0.5ms),测得的波形如下:

图4

图4 随着刺激频率的降低,动作电位波形发生改变.

根据波形分析可知刺激间隔为3ms时相对不应期出现, 两个动作电位的峰开始融合,当间隔为2ms时,绝对不应期开始出现,第二个动作电位的峰几乎消失,当时间间隔进一步缩减到1.5ms时第二个动作电位的峰完全消失, 此时进入绝对不应期——第二次刺激无法产生动作电位.

样品坐骨神经纤维传导速率的测定

如前所述, 神经纤维就像电线一样能够传递电信号, 不同种类的电线导电能力不同, 同理,不同的神经纤维导电能力不同, 因此我们以1.5cm距离长度为标准, 多次测算了电信号在两个电极间传播所需要的时间.得到波形图和计算结果如下:

图5 a
图5 b

图5 a ch1与ch2接收到的信号波形图 图5 b 计算数据

实验结果如图5 b所示,由于前两个波形性状并不理想,且得到的数值与后续数值有显著差异, 经相关性检验后(假设我真的做了,其实我没做,真的不是不会!QAQ)去除前两个离群值,对剩下数据结果进行平均得到27.6899m/s的传导速度. 与其他组对比,该数值略有偏低, 后续会进一步讨论其原因.

实验结论

样品牛蛙坐骨神经的极限动作电位约为3.78mV, 该动作电位可由约3V的电刺激(最大刺激或最适刺激)引发,并导致约为16g的腓肠肌收缩张力(最大收缩). 与此同时, 样本坐骨神经在刺激为1V时产生动作电位(即阈强度为1V) 提高刺激频率达到9Hz可以使样本腓肠肌出现强直收缩 . 除此之外,其坐骨神经的相对不应期和绝对不应期分别为3ms和1.5ms, 对应的信号传导速率约为28m/s. 该速率相比讲义上的参考速率较慢.可能是该坐骨神经在测定传导速率前已经离体并进行别的实验较长一段时间,使得神经纤维部分活性降低甚至死亡(也可能是坐骨神经纤维表面有残余组织). 在解剖和实验过程中应尽可能的是使神经纤维保持湿润并处于任氏液的氛围中.

讨论

1. 剥去皮肤后的后肢其神经纤维暴露在自来水的离子氛中会引发神经纤维的电位变化,进而影响神经元活性,因此不能.
2. 金属器械本身可能锐利,可能对神经纤维造成物理损伤, 其次金属在接触神经时其表面的离子会有或多或少的溶解,神经元本身对离子的微量变化敏感,会造成自来水洗一样甚至更严重的后果(神经元活性降低).
3. 要使标本机能维持正常应该使其神经元处在类细胞外液的离子氛围中并保持营养供应. 即实验过程中应时不时用任氏液润湿样本或者直接将样本浸泡在其中进行保存.
4. 可以通过用铜锌弓给坐骨神经适当的电刺激使其兴奋引发腓肠肌收缩来检验标本兴奋性, 腓肠肌收缩力度越强其坐骨神经的兴奋性越强. 本样品兴奋性相较其他组员的样品兴奋性为中等水平(从阈电位, 最大张力, 信号传导速度等角度综合查看).
5. 肌肉的强直收缩通常由高频刺激引发. 随着刺激频率逐渐增大, 当肌肉还未完全放松时, 下一刺激就到达从而引发不完全强直收缩, 直到(临界融合刺激频率)肌肉还未开始放松时下一刺激就已到达形成完全强直收缩. 日常生活中人们需要持续用力的行为都属于强直收缩(站立, 拾取等).
6. 在测量传导速度时电极距离可以尽可能的远以减小误差, 但是距离越远神经纤维上传到的信号衰减的越多, 因此两电极间距离续合适.
7. 香辣牛蛙制作时的注意事项(引自baidu):
   1. 牛蛙要提前用盐和料酒拌匀腌制10分钟，这样可以去除腥味。
   2. 爆香干辣椒时火候不要过大，以免烧焦影响口感。
   3. 加水时不能太多，否则汁收不干会影响口感。

致谢

感谢李瑞林同学于鄙人困顿之时送来能打开.time文件的软件,他简直是神! 感谢申老师让我在实验室就能享受到专家级医疗服务! 感谢张笑同学害我笑了一下! 感谢所有同组同学! 感谢脊蛙做出的伟大牺牲! 感谢全世界!

基金

本实验由中国科学院大学UCAS支持

参考文献

“牛蛙”有几种好吃的做法？怎样做更好吃？. (n.d.). Retrieved December 25, 2024, from https://baijiahao.baidu.com/s?id=1766903351401257852

申雪峰-深圳理工大学. (n.d.). Retrieved December 16, 2024, from https://www.suat-sz.edu.cn/info/1175/2240.htm

脊蛙. (n.d.). 百度百科. Retrieved December 16, 2024, from https://baike.baidu.hk/item/%E8%84%8A%E8%9B%99/9566531

课程讲义

方法

实验相关用品

制取坐骨神经一腓肠肌标本

首先，左手握住脊蛙，确保背部朝上（如图 6 a 所示）。接着，使用食指按压脊蛙头部前端，同时用拇指固定住躯干的背部，使其头部向前俯下。右手则握住毁髓针，从脊蛙两眼之间的中线向后划动，直到触及两耳后腺之间的凹陷处，这里正是枕骨大孔的位置。

在确定位置后，垂直刺入毁髓针，直达枕骨大孔。然后，轻轻将针尖向前推进，进入颅腔内并进行搅动，以破坏脑组织。在此过程中，实验者会感受到针触碰到颅骨，此时脊蛙成为单毁髓动物。接下来，将毁髓针退回至枕骨大孔，并将针尖调整至后方，平行于脊柱刺入椎管，以捣毁脊髓。当脊髓完全被捣毁时，脊蛙的后肢会突然伸直，随后变得松软，此时动物即为双毁髓动物。

如果脊蛙仍表现出四肢肌肉紧张或活动自如，需重新进行毁髓。操作时请务必保持脊蛙头部向外，避免挤压耳后腺，以防分泌物意外射入实验者眼中。如不慎被射入，应立即用生理盐水冲洗眼睛。

图6 a 摘自讲义	图6 b 摘自讲义

一只手提着脊蛙的下肢使其倒悬, 此时内脏受重力作用靠着胸腔堆积给腹腔留出了空间. 用手术剪小心剪开腹部,并将脊蛙平躺放置在蜡盘中. 将内脏扒开, 清理掉血管与组织纤维,露出脊椎骨.理清神经纤维,用金冠剪自基部(脊神经以上)将脊椎剪断.

从断口撕开外层皮肤进一步将整条裤子脱下来(注意不要用指甲抠蛙体以免损伤神经). 蜕皮成功后, 腹面向上置于砧板上,用手术剪避开神经减去股骨外的肌肉组织,随后用金冠剪自股骨上向下按压并剪断.

将一侧后肢的脊柱端腹面朝上，趾端向外翻转，使足底朝上（如图 6 b 左所示）。然后，使用玻璃解剖针理清神经脉络并沿脊神经向后分离坐骨神经。在股部时，沿腓肠肌前方的股二头肌和半膜肌之间的裂缝寻找坐骨神经。坐骨神经的基部（与脊神经相接的部位）被梨状肌覆盖，轻轻用玻璃解剖针挑起此肌肉即可清楚看到坐骨神经的穿行位置。

剪断梨状肌后，完全暴露坐骨神经及其与脊神经的连接。接着，用玻璃解剖针轻轻挑起神经，自前向后剪去支配腓肠肌以外的分支，将坐骨神经分离至腘窝。使用金冠剪修剪脊柱骨及周围肌肉，仅保留坐骨神经发出部位的一小块脊柱骨。

左手捏住股骨，沿膝关节剪去股骨周围的肌肉，用金冠剪 自膝关节向前刮干净股骨上的肌肉。保留股骨的后$\frac{2}{3}$，剪断股骨。随后, 用手术镊（尖头镊）在腓肠肌跟腱下穿线，并进行结扎。然后，提起结扎线，剪断腓肠肌与胫腓骨之间的联系，从而游离腓肠肌。接下来，剪去膝关节下部的后肢，确保腓肠肌与股骨仍然相连，以制备一个完整的坐骨神经—腓肠肌标本。该标本应包括坐骨神经、腓肠肌、股骨头以及一段脊柱骨（如图6 b 右 所示）。

在检验标本时，左手握住手术镊，轻轻提起脊柱骨片，使神经离开玻璃板。右手则持有用任氏液蘸湿的锌铜弓(需提前清理表面氧化物)，使其两极接触神经。如果腓肠肌发生收缩，说明标本机能正常。此时，右手提起腓肠肌上的结扎线，轻轻将标本放入任氏液中，注意避免对神经造成牵拉，稳定保持15-20分钟后，即可进行后续实验。

注意，制备标本过程中经常用任氏液湿润去皮的标本。

刺激强度与骨骼肌收缩反应的关系/骨骼肌收缩的总和与强直收缩

如图7所示, 将标本的股骨头固定在肌槽的股骨固定孔内。肌槽电极接通Ch1. 肌腱上的结扎线穿过定滑轮与张力换能器相连。张力换能器连接 RM-6240C 生理记录仪(接电脑)。将神经搭在肌槽的电极上。刺激电极的接头与RM-6240C的刺激输出连接。

图7 a 供图:李瑞林	图7 b 摘自讲义

随后在电脑软件上设置相关参数进行实验.

神经冲动传导速度的测定/坐骨神经干不应期的测定/刺激强度,频率与动作电位的关系

将上一步实验的套索从张力转换器上取下, 肌槽接上Ch2信号在操作平台上进行进一步实验操作.

Math and Data

速度计算公式: $$ v=\frac{S}{t} \quad(m/s) $$ Logist回归: $$ \hat{y}=\frac{A}{1+e^{-B(x-C)}} $$ 其中:

• A：曲线最大值（上限值）。
• B：斜率参数，决定曲线的陡峭程度。
• C：拐点位置（x 值对应 y 为 A/2 的位置）。 R方: $$ R^2=1-\frac{\sum(\hat{y}-y_i)^2}{\sum(y_i-\bar{y})^2} $$ 其中:
• $\hat{y}$是回归预测值
• $\bar{y}$是观测平均值
• $y_i$是观测值

同组组员数据

图8

图8 来自其他组员的数据

图9 a	图9 b

图9 a. 团队留影(全班福) 图9 b. 提前采购用于实验的食品级牛蛙, 干净卫生, 生理状态健康.